一、膜剥离（Stripping）
目的是去除已结合的抗体，保留膜上的目标蛋白，以便用新抗体重新检测。
1. 常用剥离缓冲液配方
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温和剥离液（适用于多数情况）：
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15 g 甘氨酸
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1 g SDS
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10 mL Tween-20
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加ddH₂O至1 L，pH调至2.2（用HCl）。
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作用：低pH和SDS破坏抗体-抗原结合，甘氨酸中和残留试剂。
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强效剥离液（针对顽固信号）：
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62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)
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2% SDS
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100 mM β-巯基乙醇（现加现用，还原二硫键）。
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2. 操作步骤
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洗涤膜：用TBST洗膜3×5分钟，去除残留显色液。
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剥离处理：
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将膜浸入剥离液（25–50 mL），室温摇动10–30分钟（或55°C 10分钟）。
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观察信号是否消失（可用增强化学发光ECL短暂曝光确认）。
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彻底洗涤：用TBST洗膜3×10分钟，中和残留剥离液。
3. 注意事项
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避免过度剥离：强效剥离液或长时间处理可能破坏蛋白。
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膜完整性：PVDF膜比NC膜更耐剥离，但反复操作可能导致蛋白丢失。
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验证保留：用总蛋白染料（如丽春红或考马斯蓝）确认蛋白未被洗脱。
二、重新检测（Reprobing）
1. 封闭
用5%脱脂牛奶或3% BSA的TBST封闭1小时，减少非特异结合。
2. 一抗孵育
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使用新一抗（建议与首次检测的抗体来源不同，如首次用兔源，第二次用鼠源）。
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稀释比例可能需优化（通常比首次高10–20%）。
3. 二抗孵育及显色
与常规Western流程相同。
三、常见问题与解决方案
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残留信号：
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原因：剥离不彻底。
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解决：延长剥离时间或更换强效缓冲液。
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背景高：
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原因：封闭不充分或洗涤不足。
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解决：增加封闭时间或更换封闭剂（如BSA替代牛奶）。
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信号弱或无：
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原因：蛋白被过度剥离或抗体效价低。
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解决：缩短剥离时间，或提高一抗浓度。
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多次剥离后膜损坏：
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建议：最多剥离2–3次，后续检测改用平行泳道或新膜。
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四、替代方案
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分次检测：在同一膜上切割不同分子量区域，分别孵育不同抗体。
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荧光二抗：使用不同荧光标记的二抗（如IRdye 680/800），无需剥离即可多靶点检测。
通过合理优化条件，剥离和重新检测可有效节省样本和成本，但需平衡信号质量与膜重复使用次数。
